Vi Khuẩn Cần Xem Xét cho Bài Kiểm Tra Thúc Đẩy Sự Phát Triển: Có Nên Bao Gồm Các môi trường kỵ khí?

Bacteria to Consider for the Growth Promotion Test: Should Anaerobic Cultures Be Included?

Giới Thiệu Mục đích của Bài Kiểm Tra Thúc Đẩy Sự Phát Triển (GPT) là để xác định sự phù hợp của môi trường nuôi cấy sẽ được sử dụng trong lấy mẫu giám sát môi trường. Môi trường được thách thức với một số lượng nhỏ vi sinh vật để đảm bảo các tính chất dinh dưỡng, chức năng và chất lượng môi trường đủ tốt cho việc phát hiện và đếm vi sinh vật gây ô nhiễm.

Bài kiểm tra được mô tả trong Chương <61> USP, Kiểm Tra Vi Sinh Học Của Sản Phẩm Không Vô Trùng: Các Bài Kiểm Tra Đếm Vi Sinh Vật, Chương <62> USP, Kiểm Tra Vi Sinh Học Của Sản Phẩm Không Vô Trùng: Các Bài Kiểm Tra Chất Định Tỷ, và Chương <71> USP, Các Bài Kiểm Tra Vô Trùng. Nó cũng được tìm thấy trong các chương tương ứng của Dược điển Châu Âu 2.6.12, 2.6.13, và 2.6.1.

Bài kiểm tra có thể được thực hiện trên môi trường rắn và trong nước dịch theo Dược điển Châu Âu và Hoa Kỳ. GPT được thực hiện bằng cách tiêm chủng sản phẩm với ≤ 100 CFU vi sinh vật, được xác định bởi dược điển. Bài kiểm tra có thể là định lượng, tại đó 50 – 200% vi sinh vật tiêm chủng nên được phục hồi sau khi ủ môi trường, hoặc có thể là định tính, nơi yêu cầu là “có sự phát triển” hoặc “không có sự phát triển”.

Quan trọng là phải nhấn mạnh rằng GPT phải được kiểm tra cho mỗi lô môi trường mới. Sự thúc đẩy sự phát triển phải được kiểm tra trên môi trường agar và nước dịch dinh dưỡng nhưng không phải trên nước dịch loãng.

Quy trình cần theo là được tóm tắt dưới đây:

1. Môi trường mới được tiêm với 100 hoặc ít hơn CFU vi sinh vật.
2. Các vi sinh vật được khuyến nghị bởi dược điển được sử dụng trong bài kiểm tra. Vi sinh vật không được quá 5 lần chuyển giao từ lô môi trường gốc tham chiếu ban đầu.
3. Sau khi ủ, sự phát triển trên lô môi trường mới được so sánh với sự phát triển trên lô môi trường đã được chấp nhận trước đó.

Tiêu chí chấp nhận cho bài kiểm tra này như được mô tả trong Chương <61> USP, Kiểm Tra Vi Sinh Học Của Sản Phẩm Không Vô Trùng: Các Bài Kiểm Tra Đếm Vi Sinh Vật, là: "Nếu kiểm tra agar, số lượng cụm trên lô môi trường mới phải nằm trong khoảng gấp đôi số lượng cụm trên môi trường đã được chấp nhận trước đó. Nếu kiểm tra nước dịch, môi trường mới và môi trường đã được chấp nhận trước đó phải tương đương về hình dạng.”

Quan trọng là phải làm rõ rằng một yếu tố gấp đôi có nghĩa là số lượng cụm trên agar mới không được nhiều hơn gấp đôi và không ít hơn một nửa số lượng cụm trên agar đã được chấp nhận trước đó. Ví dụ, nếu số lượng cụm trên agar đã được chấp nhận trước đó là 30, thì số lượng cụm chấp nhận được trên agar mới nên nằm trong khoảng từ 15 đến 60.

Để đảm bảo thành công cho Bài Kiểm Tra Thúc Đẩy Sự Phát Triển (GPT), hãy tuân thủ các khuyến nghị sau:

1. Kiểm tra môi trường mới và môi trường đã được chấp nhận trước đó cạnh nhau.
2. Khi kiểm tra môi trường chọn lọc, hãy kiểm tra môi trường không chọn lọc song song.
3. Sử dụng một dụng cụ phết để phết mẫu cấy vào sao cho các tế bào không dính vào nhau.
4. Sử dụng máy khuấy vortex để trộn hỗn hợp sau khi đưa từng mẫu cấy vào

GPT hiếu khí - Danh sách khuyến nghị vi sinh vật cho GPT:

Bảng 1. Danh Sách Khuyến Nghị Vi Sinh Vật cho GPT VI SINH VẬT

THÚC ĐẨY SỰ PHÁT TRIỂN (HIẾU KHÍ) : TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ / TỔNG SỐ NẤM MEN VÀ MỐC

Staphylococcus aureus ATCC 6538 *^ Agar và Nước Dịch Digest Đậu Nành–Casein, 30 –35 , 3 ngày Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 ~ Agar và Nước Dịch Digest Đậu Nành–Casein, 30 –35 , 3 ngày Bacillus subtilis ATCC 6633 Agar và Nước Dịch Digest Đậu Nành–Casein, 30 –35 , 3 ngày Candida albicans ATCC 10231 Agar và Nước Dịch Digest Đậu Nành–Casein, 30 –35 , 5 ngày Agar Dextrose Sabouraud 20 –25 , 5 ngày Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 Agar và Nước Dịch Digest Đậu Nành–Casein, 30 –35 , 5 ngày Agar Dextrose Sabouraud 20 –25 , 5 ngày

• Một lựa chọn thay thế cho Staphylococcus aureus là Bacillus subtilis (ATCC 6633) ~ Một lựa chọn thay thế cho P. aeruginosa là Micrococcus luteus (Kocuria rhizophila) (ATCC 9341). ^ Một Staphylococcus bổ sung là S. epidermidis (ATCC 12228) (vi khuẩn gram dương, và là một trong hơn 40 loài thuộc chi Staphylococcus. Nó là một phần của hệ vi sinh vật bình thường của con người, thường là vi sinh vật da, và ít thường gặp hơn là vi sinh vật niêm mạc.)
• Chú ý: Tất cả các môi trường phải không quá 5 lần chuyển giao từ môi trường gốc.

Bao Gồm Các Nền môi trường  kỵ khí:  trong Bài Kiểm Tra Thúc Đẩy Sự Phát Triển Giám sát môi trường  kỵ khí  không phải là quá trình thường xuyên, nhưng đôi khi được thực hiện để phát hiện các vi sinh vật gây ô nhiễm  kỵ khí tiềm năng, đặc biệt là những liên quan đến ô nhiễm do nhân viên.

Về mặt thực tế, có ba loại vi sinh vật kỵ khí:

• Bắt buộc, bị tổn hại bởi sự hiện diện của oxy.

• Chịu đựng Oxy, không sử dụng oxy để phát triển, nhưng chịu đựng sự hiện diện của nó.

• Tùy chọn, có thể phát triển không cần oxy nhưng sử dụng oxy nếu nó có mặt.

Hình: Theo dõi ô nhiễm do nhân viên thực hiện với các đĩa agar đã được xác nhận sử dụng Máy Lấy Mẫu Không Khí Vi Sinh Di Động MiniCapt® và Bộ Tác Động Vi Sinh BioCapt®

Propionibacterium acnes là một loài vi khuẩn  kỵ khí:  phát triển chậm, thường là aerotolerant, Gram dương (hình que) liên kết với tình trạng mụn trên da. Nó thường đòi hỏi điều kiện ủ  kỵ khí  và thời gian ủ kéo dài. Vi khuẩn này chủ yếu là cộng sinh và là một phần của hệ vi sinh vật da tồn tại trên da của hầu hết người lớn khỏe mạnh. Vì Propionibacterium acnes là một vi sinh vật phổ biến thường trú trên da người, nó có thể hoạt động như là chỉ số vệ sinh cá nhân. Hơn nữa, nó có thể được bảo vệ khỏi việc khử trùng, ví dụ như xử lý VHP, bởi vì nó được biết đến như một vi sinh vật liên quan đến màng sinh học.

Các chủng kiểm soát kỵ khí được đề xuất:

1. Propionibacterium acnes ATCC 11827 hoặc 6919 (Gram dương, aerotolerant anaerobic)
2. Clostridium sporogenes ATCC 19404 hoặc 11437 (Gram dương, anaerobic bắt buộc)*
3. Bacteroides fragilis ATCC 25285 (Gram âm, anaerobic bắt buộc, vi khuẩn hình que. Nó là một phần của hệ vi sinh vật bình thường của ruột già người và chủ yếu là cộng sinh)

• Một lựa chọn thay thế cho Clostridium sporogenes, khi muốn sử dụng một vi sinh vật không tạo bào tử, là Bacteroides vulgatus (ATCC 8482).

Đĩa Agar cho môi trường kỵ khí: Có thể sử dụng đĩa vi sinh thông thường hoặc đĩa tiếp xúc cho GPT của các môi trường kỵ khí. Chúng có thể chứa Agar Đậu Nành–Casein (TSA) hoặc Agar Dextrose Sabouraud (SDA), và được bổ sung với chất trung hòa của nhiều loại chất khử trùng, hoặc kháng sinh β-lactam để giám sát bề mặt khô đã được khử trùng. Chất trung hòa như lecithin (L), Tween® 80 (T), histidine (H) và natri thiosulfate (Th) có khả năng vô hiệu hóa dư lượng của chất khử trùng, phạm vi rộng lớn của các loại chất khử trùng được sử dụng trên toàn thế giới.

Đĩa bổ sung với cephalosporinase (cephase) hoặc penicillinase (penase) có thể vô hiệu hóa phổ rộng của kháng sinh β-lactam. Quan trọng là phải xác minh trong quá trình xác nhận GPT rằng đĩa môi trường agar sử dụng cho phép trao đổi khí đúng cách với bầu khí quyển của buồng kỵ khí . Đĩa TSA có thể được ủ an toàn trong phạm vi từ 30 °C đến 37 °C cho những môi trường kỵ khí này.

Tham Khảo

1. References 1. Hogg, S. (2005). Essential Microbiology (1st ed.). Wiley. pp. 99–100.
2. 2. U.S. FDA, Office of Regulatory Affairs, Pharmaceutical Microbiology Manual. 2014.
3. 3. USP Sterility Test.
4. 4. USP Microbiological Examination of Nonsterile Products: Microbial Enumeration Tests.
5. 5. USP. Microbiological Examination of Nonsterile Products: Tests for Specified Microorganisms

Tác Giả Claudio Denoya, Tiến sĩ. Particle Measuring System